特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品(foods for special medical purpose, FSMP),簡稱特醫(yī)食品。我國特醫(yī)食品行業(yè)由于起步較晚,目前規(guī)模相對較小,但是近年來呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢,截至2024年7月1日,共有192款特醫(yī)食品獲批,第一季度與第二季度分別新增特醫(yī)食品17款與11款。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則中明確規(guī)定多種維生素含量。其中維生素A和D是人體生長發(fā)育的必需物質(zhì),尤其對胎兒、嬰幼兒的發(fā)育,上皮組織的完整性,視力,生殖器官,血鈣和磷的恒定,骨骼、牙的生長發(fā)育有重要作用。維生素E是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑,能抑制不飽和脂肪酸的氧化,減少過氧化脂質(zhì)的形成以及對機體生物膜的損害,有抗衰老、抗癌及防止動脈粥樣硬化作用 [1]。
目前有關(guān)配方食品中,維生素 ADE 的測定方法較多,其中操 作步驟中對于脂溶性維生素基本都要經(jīng)過皂化、提取、洗滌、 濃縮等復(fù)雜的前處理步驟,并且無法實現(xiàn)一個方法完成以上幾 種維生素的同時測定。賽默飛液相團(tuán)隊從 2010 年開始嘗試?yán)?用特色的雙三元液相系統(tǒng),結(jié)合二維色譜實現(xiàn)維生素 A、維生素 D2、D3 以及維生素 E 四種同分異構(gòu)體的同時測定,前后共推出六代方法對該方案進(jìn)行不斷優(yōu)化。本文在先前研究的[2]基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化模塊配置、流動相組成、色譜柱型號、方法梯度等,提高了方法穩(wěn)定性以及幾種維生素的分離度,并在二維色譜的基礎(chǔ)上,通過增加在線固相萃取的設(shè)定,將傳統(tǒng)的人工液液萃取、洗滌和干燥濃縮等步驟同時轉(zhuǎn)移到儀器自動完成, 大大簡化了前處理過程,減少有機溶劑的使用以及與實驗人員的接觸,使整個實驗更加環(huán)保,大大降低實驗成本的同時也提高了實驗的安全性。
實驗部分
儀器:ThermoFisher Vanquish Core 高效液相色譜儀 SPE 泵:Vanquish Quaternary Pump (VC-P20-A-01) 一維、二維泵:Vanquish Dual Pump (VC-P33-A-01) 自動進(jìn)樣器:Vanquish sampler CT (VC-A12-A-02, 100μL 定 量環(huán)) 柱溫箱:Vanquish Column Compartment C(VC-C10-A-03, 含兩個 2p-6p 切換閥) 檢測器:Variable Wavelength Detector C(VC-D40-A-01, 含11μL流通池) Vanquish Diode Array Detector HL (VH-D10-A, 含 60mm 流通池)
色譜軟件:Chromeleon Chromatography Data System7.3.1
樣品前處理及標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備:參考AN_24019_HPLC 在線固相萃取聯(lián)用二維液相色譜測定食品中維生素 A、D、E及異構(gòu)體含量
在線固相萃取-二維液相色譜法測定
在線固相萃取-二維液相色譜(Online SPE-2D-LC)系統(tǒng)連接見圖1所示
(1D, 第一維; 2D, 第二維; SPE, 在線固相萃取柱; Trap, 捕集柱)
實驗結(jié)果與討論:
對照品和樣品溶液譜圖
維生素A、維生素E四個同分異構(gòu)體和維生素D2、維生素D3對照品和樣品溶液一維和二維分析譜圖見圖2-a、b、c。
圖2a 維生素A對照品及樣品一維325 nm譜圖(上圖為對照品,下圖為樣品)(點擊查看大圖)
圖2b 維生素E對照品及樣品一維294 nm譜圖(上圖為樣品,下圖為對照品)(點擊查看大圖)
圖2c 維生素D對照品及樣品一維 264 nm譜圖(上圖為對照品,下圖為樣品)(點擊查看大圖)
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線性及靈敏度
按照表1標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度配置溶液,分別進(jìn)樣100μL,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),考察方法的線性范圍及定量限。結(jié)果顯示,各維生素在其濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均>0.999。方法靈敏度較高,滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,方法線性及檢測限(S/N>3)結(jié)果見表3,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3,最低濃度的分離圖譜見圖5。
表3 方法線性及靈敏度
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精密度
采用7#濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6針考察精密度。結(jié)果如表4所示,6針樣品各峰的峰面積RSD%均小于0.31%,滿足方法要求,體現(xiàn)Vanquish Core液相色譜良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。見表4。
表4 樣品連續(xù)進(jìn)樣結(jié)果(n=6)
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回收率
取一定量的樣品,加入適量的標(biāo)準(zhǔn)液,按照2.5.2前處理后,分別測定維生素ADE的含量,計算出樣品與標(biāo)準(zhǔn)濃度扣除樣品濃度后的加標(biāo)回收率。見表5。
表5 回收實驗結(jié)果(n=6)
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樣品測試結(jié)果
采用上述方法對市售配方奶粉和特殊醫(yī)學(xué)配方食品樣品進(jìn)行測試,結(jié)果如表6顯示,樣品基質(zhì)對目標(biāo)維生素測試無干擾,表明方法適合不同食品中維生素A、D、E含量的測定。
表6 樣品測試結(jié)果
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結(jié)論
本文采用賽默飛Vanquish Core液相色譜,在前期數(shù)代二維液相色譜同時測定食品中維生素A、D、E方案基礎(chǔ)上,建立了一種皂化液直接稀釋上樣,測定維生素A、維生素D2、D3以及維生素E四種同分異構(gòu)體的方法。該方法采用全自動在線SPE結(jié)合中心切割二維液相色譜取代傳統(tǒng)的液液萃取和進(jìn)一步純化,簡化了樣品的整個分析工作流程。方法學(xué)實驗結(jié)果表明本方法靈敏度、線性、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確度均良好。實驗簡化樣品前處理過程,縮短樣品分析周期,大幅提高了分析效率及降低實驗成本。利用賽默飛獨特的雙三元液相,模塊搭建更緊湊,一套液相的臺面占地可以完成多套液相的測試工作,為企業(yè)節(jié)省了空間及時間成本。
參考文獻(xiàn):
[1] 宋前流,陳群. 用藥護(hù)理. 北京. 人民軍醫(yī)出版社. 2014. 353-355頁
[2] AN_20071_HPLC. 在線固相萃取-二維液相色譜法分析配方奶粉中的維生素A、D和E異構(gòu)體含量.
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